人N端中段骨鈣素(N-MID-OT)ELISA試劑盒操作流程如下：

（1）待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl，每種樣品設3個平行孔；設兩個陰性對照孔，每孔加未處理組的細胞裂解液100μl；另設一個空白對照孔，加入純細胞裂解液100μl。　

（2）酶標板置4℃，包被過夜。

（3）洗板：吸干孔內反應液，用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去），之后將洗滌液注滿板孔，浸泡1-2分鐘，間歇搖動。甩去孔內液體后在吸水紙上拍干。重復洗滌3-4次。

（4）陰性對照孔每孔加入PBS 50μl，樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl。　

（5）酶標板置37℃培養箱的濕盒內，孵育60min。　

（6）洗板，同（4）。　

（7）每孔加1:5000稀釋的HRP-標記的山羊抗兔抗體工作液 100μl。　

（8）酶標板置37℃培養箱的濕盒內，孵育60min。　

（9）洗板，同（4）。　

（10）每孔加TMB顯色液 100μl，輕輕混勻10s，置37℃暗處反應15-20min。　

（11）每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應。　

（12）分別測450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，zui終測得的OD值為兩者之差（W1-W2），以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

（13）數據處理：在得出標本（S）和陰性對照（N）的 OD值后，計算S/N值。S/N≥2.1為陽性判定標準。

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